ජාන ක්ලෝන කිරීම හා තෝරා ගැනීම
ඒකකය 7 · අණුක ජීව විද්‍යාව හා ප්‍රතිසංයෝජිත DNA තාක්ෂණය
ප්ලාස්මිඩයක ජානයක් ක්ලෝන කිරීමේ පියවර, බැක්ටීරියා පරිණාමනය සහ ප්‍රතිසංයෝජිත DNA රැගත් සෛල හඳුනාගැනීමට ප්‍රතිජීවක ප්‍රතිරෝධය හා නිල්-සුදු තෝරා ගැනීම යොදා ගන්නා ආකාරය.
ජානයක් ක්ලෝන කිරීමේ පියවර
- අවශ්‍ය ජානය (ජීනෝමයෙන්, cDNA ලෙස, හෝ PCR මගින්) හා වාහක DNA (බැක්ටීරියාවලින් පිරිසිදු කළ ප්ලාස්මිඩය) හුදකලා කරන්න.
- දෙකම එකම සීමාකාරක එන්සයිමයෙන් කපන්න; අනුපූරක ඇලෙන සුළු කෙළවර ලැබේ.
- සම්බන්ධ කරන්න: කැපූ වාහකය හා ජානය මිශ්‍ර කර ඇලෙන සුළු කෙළවර යුගල වීමට සලස්වා, ප්‍රතිසංයෝජිත ප්ලාස්මිඩ සෑදීමට DNA ලයිගේස් එකතු කරන්න.
- ප්‍රතිසංයෝජිත ප්ලාස්මිඩය ධාරක බැක්ටීරියාවලට පරිණාමනය කරන්න.
- ප්‍රතිසංයෝජිත ප්ලාස්මිඩය රැගත් බැක්ටීරියා, එසේ නොකළ බොහෝ ඒවා අතරින් තෝරන්න.
- ජානයේ පිටපත් රැසක් සෑදීමට (ක්ලෝනයක්) හෝ ප්‍රෝටීනය සෑදීමට තෝරා ගත් සෛල වගා කරන්න.
බැක්ටීරියාවලට DNA ඇතුළු කිරීම: පරිණාමනය
බැක්ටීරියා සාමාන්‍යයෙන් නිරාවරණ DNA ලබා නොගන්නා බැවින් සෛල සමත් (competent) කරනු ලැබේ:
- රසායනික ක්‍රමය: සෛල සීතල කැල්සියම් ක්ලෝරයිඩ් (CaCl₂) ද්‍රාවණයෙන් සෝදා, ප්ලාස්මිඩය සමඟ මිශ්‍ර කර, කෙටි තාප කම්පනයක් (තත්පර 45ක් 42 °C පමණ) ලබා දී නැවත අයිස් මත තබයි. මෙයින් පටලය DNA වලට තාවකාලිකව පාරගම්‍ය වේ.
- විද්‍යුත් සිදුරුකිරීම: ඉහළ වෝල්ටීයතා කෙටි ස්පන්දනයක් පටලයේ සිදුරු විවෘත කරයි.
සෛල 10⁴ - 10⁵ කින් එකක් පමණ ප්ලාස්මිඩයක් ලබා ගන්නා අතර ලයිගේස් කිරීමේ මිශ්‍රණයේ බොහෝ ප්ලාස්මිඩ ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩයක් නොමැතිව නැවත වැසී යන බැවින් තෝරා ගැනීම අත්‍යවශ්‍ය ය.
පරිණාමනය වූ සෛල තෝරා ගැනීම
1 පියවර: ප්‍රතිජීවක ප්‍රතිරෝධය (ප්ලාස්මිඩ ඇති බැක්ටීරියා සොයා ගැනීම)
සෛල ඇම්පිසිලින් අඩංගු අගාර් මත පතුරවයි. ප්ලාස්මිඩ නැති සෛල මිය යයි. ඇම්පිසිලින් විනාශ කරන එන්සයිමයක් වන β-ලැක්ටමේස් සාදන ampR ජානය රැගත් ප්ලාස්මිඩයක් ලබා ගත් සෛල පමණක් ජනපද සාදයි. සෑම ජනපදයක්ම වර්ධනය වන්නේ තනි සෛලයකිනි, එබැවින් එය ක්ලෝනයකි.
2 පියවර: නිල්-සුදු තෝරා ගැනීම (ප්‍රතිසංයෝජිත ප්ලාස්මිඩ සොයා ගැනීම)
ප්ලාස්මිඩ ඇති සෛල අතරද සමහරක ප්ලාස්මිඩ ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩයක් නොමැතිව වැසී ඇත. pUC19 වැනි වාහකයක බහු ක්ලෝන කිරීමේ අඩවිය β-ගැලැක්ටොසයිඩේස් එන්සයිමයේ කොටසක් සාදන lacZ′ ජානය තුළ පිහිටා ඇත. අගාර් වල X-gal අඩංගු ය; එය වර්ණ රහිත උපස්ථරයක් වන අතර β-ගැලැක්ටොසයිඩේස් මගින් නිල් පැහැයට හැරේ.
- ප්‍රතිසංයෝජිත නොවන ප්ලාස්මිඩය: lacZ′ නොවෙනස්ව ඇත, β-ගැලැක්ටොසයිඩේස් සෑදේ, X-gal කැපී ජනපදය නිල් වේ.
- ප්‍රතිසංයෝජිත ප්ලාස්මිඩය: ඇතුළත් කළ ජානය lacZ′ බිඳියි, β-ගැලැක්ටොසයිඩේස් නොසැදේ, ජනපදය සුදු වේ.
එබැවින් සුදු ජනපද තෝරා ගනී. මෙම ක්‍රමය ඇතුළත් කිරීමෙන් අක්‍රිය කිරීම ලෙස හැඳින්වේ. (pBR322 වැනි පැරණි වාහකවල ඒ වෙනුවට දෙවන ප්‍රතිජීවක ජානයක් භාවිත කළහ: ඇම්පිසිලින් මත වර්ධනය වන නමුත් ටෙට්‍රාසයික්ලීන් මත නොවර්ධනය වන ජනපදයක ටෙට්‍රාසයික්ලීන් ප්‍රතිරෝධ ජානයේ ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩයක් ඇති අතර එය ප්‍රතිරූප තැටි ගත කිරීමෙන් සොයා ගනී.)
| ඇම්පිසිලින් + X-gal මත ජනපදය | ප්ලාස්මිඩය | ජානය ඇතුළත් කර තිබේද? |
|---|---|---|
| වර්ධනයක් නැත | නැත | පරිණාමනය වී නැත |
| නිල් | ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩයක් නැති ප්ලාස්මිඩය | නැත |
| සුදු | ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩයක් ඇති ප්ලාස්මිඩය | ඔව් |
සුදු ජනපදයක වැරදි ඛණ්ඩයක් තවමත් තිබිය හැකි බැවින් ක්ලෝනය තහවුරු කරන්නේ ප්ලාස්මිඩය කපා ජෙලයක ධාවනය කිරීමෙන්, PCR මගින්, හෝ ජානයට ගැළපෙන ලේබල් කළ තනි-සූත්‍රිකා DNA පරීක්ෂකයක් යොදා ජනපද දෙමුහුන් කිරීමෙන් ය.
ක්ලෝන කළ ජානය ප්‍රකාශ කිරීම
ධාරකයේ ප්‍රෝටීනයක් සෑදීමට ජානයට ධාරකයට භාවිත කළ හැකි සංඥා අවශ්‍ය ය: ධාරකයේ ක්‍රියා කරන ප්‍රවර්ධකයක්, රයිබසෝම බන්ධන අඩවියක් හා ආරම්භක හා අවසාන කෝඩෝන. ප්‍රකාශන වාහක මෙම සංඥා රැගෙන යයි (උදා: lac ප්‍රවර්ධකය වැනි ප්‍රේරණය කළ හැකි ප්‍රවර්ධකයක්). බැක්ටීරියාවලට ඉන්ට්‍රෝන ස්ප්ලයිස් කළ නොහැකි බැවින් යුකැරියෝටික ජානයක් සාමාන්‍යයෙන් cDNA ලෙස ක්ලෝන කෙරේ. ග්ලයිකොසයිලීකරණය වැනි සමහර වෙනස් කිරීම් බැක්ටීරියාවලට කළ නොහැකි බැවින් සමහර ප්‍රෝටීන සඳහා යීස්ට් හෝ ක්ෂීරපායී සෛල භාවිත කෙරේ.
Exam tip: වෙන වෙනම තෝරා ගැනීමේ පියවර දෙක මතක තබා ගන්න: ඇම්පිසිලින් මගින් සෛලයේ ප්ලාස්මිඩයක් ඇති බව පෙන්වයි; නිල්-සුදු මගින් ප්ලාස්මිඩයේ ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩය ඇති බව පෙන්වයි. ඇතුළත් කළ ඛණ්ඩය lacZ′ බිඳී ඇති බැවින් අපට අවශ්‍ය වන්නේ සුදු ජනපදයයි.